一般酶標儀的測定波長(cháng)在400～750nm或800nm之間，可以滿(mǎn)足ELISA的顯色測定。ELISA試劑盒所使用的標記用酶均為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過(guò)氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長(cháng)處有最大吸收，當pH值降為L(cháng)0時(shí)，最大吸收波長(cháng)移至492nm，同時(shí)摩爾消光系數變大，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(cháng)450nm處有最大消光系數，如果HRP量少，H：O：和TMB過(guò)量時(shí)，則形成藍色的陽(yáng)離子根。降低pH，即可使藍色的陽(yáng)離子根轉變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩定90min。因此，450nm和492 nm兩個(gè)波長(cháng)是目前ELISA測定常用的。各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉換的部件，可以同時(shí)安裝6～8片濾光片，所配備的濾光片均應包括上述兩個(gè)波長(cháng)，有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大。
除了這兩個(gè)基本濾光片外，考慮到雙波長(cháng)比色的需要，還應有620nm或630nm或650nm和405nm波長(cháng)的濾光片，其他濾光片可根據自己的需要選擇。有時(shí)，有的實(shí)驗室希望用酶標儀作微量生化測定，故酶標儀生產(chǎn)廠(chǎng)家對其生產(chǎn)的酶標儀擴展了紫外檢測功能，此時(shí)需要一個(gè)340nm波長(cháng)濾光片。此時(shí)，酶標儀的測定波長(cháng)范圍就成為340—750nm或800nm。
酶標儀有單波長(cháng)和雙波長(cháng)檢測功能。有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長(cháng)檢測。所謂的“單波長(cháng)”就是使用一種對顯色具最大吸收的波長(cháng)即450nm或492nm進(jìn)行比色測定；而“雙波長(cháng)”則除了用對顯色具最大吸收的波長(cháng)即450nm或492nm進(jìn)行比色測定外，同時(shí)用對特異顯色不敏感的波長(cháng)如630nm進(jìn)行測定，酶標儀最后打印出來(lái)的吸光度則為二者之差。630nm波長(cháng)下得到的吸光度是非特異的，來(lái)自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，最好使用雙波長(cháng)，且不必設空白孔。
